2024, Vol. 45
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)已成为最直接危及生命的心血管疾病之一[1]。心肌肌钙蛋白I （cTnI）是AMI诊断的主要生物标志物，cTnI的检测可应用于AMI的早期筛查、诊断和预后[2]。光电化学（photoelectrochemical, PEC）生物免疫传感器具有灵敏度高、操作简单、易于小型化、成本低等优点，被认为是生物分析的有力工具[3]。
近年来，许多具有优异性能的半导体材料被用于设计光电化学传感器，硅纳米线（(silicon nanowire arrays, SiNWs)）是一种窄禁带（Eg=1.12 eV）半导体材料，具有较低的反射率以改善光捕获，较大的比表面积以提供更多的活性位点，快速和直接的载流子传输途径以提高载流子的分离效率等优点[4]，能成为PEC分析的高活性光电材料。碳点（carbon dots，CDs）由于其优异的光学性能、出色的导电性、低生物毒性、高化学稳定性、良好的水溶性等，被广泛应用于生物医学等领域[5-6]。CDs与半导体材料复合，一方面CDs促进电子的转移，同时可以扩大对光的吸收范围，增强半导体材料的光电性能[7-8]。
本文以含有丰富羧基的没食子酸为前驱体，以N，N−二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，通过溶剂热法制备了含有羧基的碳点（COOH-CDs）。将制备的COOH-CDs通过旋涂法修饰在SiNWs表面，在提高SiWNs光电性能的同时，为抗体的固定也提供了活性位点；通过系列表征手段对其光电性能进行探究。
1 试 验 1.1 CDS@SiNWs的制备采用金属辅助化学蚀刻法[9]制备SiNWs。首先清洗（100）硅片（n型），将硅片放置到浓硫酸：双氧水体积比为7：1的清洗液中浸泡30 min，依次用丙酮、去离子水（3次）、乙醇、去离子水（3次）进行超声清洗。将清洗好的硅片，放入5 mol/L氢氟酸和0.04 mol/L硝酸银混合溶液中蚀刻1 min，去离子水冲洗硅表面多余离子。将沉积好Ag＋的硅片放入含有0.3 mol/L过氧化氢和5 mol/L氢氟酸混合溶液中蚀刻 1 h。最后将蚀刻好的SiNWs放入浓硝酸溶液中浸泡30 min以上，去除残余银纳米颗粒得到SiNWs。
以含有丰富羧基的没食子酸为前驱体，DMF为溶剂，通过溶剂热法制备COOH-CDs。将200 mg没食子酸加入到30 mL DMF溶液中，搅拌10 min至溶液澄清；然后将烧杯中溶液转移到聚四氟乙烯(50 mL)内衬中，将内衬放入不锈钢高压反应釜，在180 ℃下溶剂热反应8 h。反应结束后，将溶液放置24 h后，通过0.22 μm的滤膜真空抽滤，经透析后得到COOH-CDs。COOH-CDs通过旋涂的方法将其修饰在SiNWs表面。旋涂速度设置为3 000 r/min，旋涂时间为30 s；重复3次，得到CDs-SiNWs电极。
1.2 材料表征采用扫描电子显微镜(scanning electron micro-scope，SEM）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）分析样品形貌。采用傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR），拉曼光谱仪（Raman spectrometer，Raman），X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）分析样品的相组成和化学键合性质。用X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）研究样品物相组成。
1.3 光电免疫测试首先，活化负载于电极表面CDs的羧基。将CDs-SiNWs电极浸泡在含有1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚氨（EDC，10 mg/mL）和 N-羟基琥珀酰亚氨（NHS，10 mg/mL）的混合溶液15 min；然后，将羧基活化后的CDs-SiNWs电极表面滴加0.1 mg/mL的肌钙蛋白抗体，在37 ℃恒温箱中孵育1 h（电极放置于湿盒中避免电极表面干燥）；反应结束后，用PBS缓冲液冲洗电极表面得CDs-SiNWs/Ab电极，然后将该电极浸泡在1 mg/mL的BSA溶液中30 min，封闭电极表面活性位点；最后，用PBS冲去未结合的BSA，得到PEC免疫传感器CDs-SiNWs/Ab/BSA电极。CDs-SiNWs/Ab/BSA免疫传感器的构建如图1所示。
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图 1 基于CDs@SiNWs的光电免疫传感器构建示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the construction of CDs@SiNWs-based photoelectrochemical immunosensor |
采用Ivium电化学工作站对电极进行光电性能测试。选用三电极体系，Ag/AgCl为参比电极，铂片（Pt）为对电极，样品为工作电极。PEC检测过程采用模拟太阳光源，光照强度为100 mW/cm2。测试在PBS（0.01 mol/L，pH=7.2）溶液中进行。进行免疫传感检测时，将不同浓度的抗原滴加到电极表面，孵育1 h；孵育完成后PBS缓冲液漂洗，得到的电极进行PEC测试。
2 结果与分析 2.1 材料结构表征从图2（a)上可以看出，在XRD谱图中29°和41.2°的位置有两个峰衍射峰，分别对应于石墨的（002）晶面和（100）晶面，可以证明所制备得到的固体是CDs。图2（a）下为SiNWs电极的XRD谱图，在69°处出现了硅的特征峰，对应（400）晶面，这表明成功制备出SiNWs[10]。为了进一步证明CDs成功修饰在SiNWs表面，对修饰前后的SiNWs进行了FTIR测试。如图2（b）所示，SiNWs在1078cm−1处的吸收峰是由Si−O的拉伸振动引起[11]。经CDs修饰后，SiNWs的红外光谱在3 436、2 934、2 856、1 629、1 430 cm−1处出现新吸收峰。其中，3 436、1 430 cm−1的吸收峰归因于−OH的伸缩振动；2 934、285 6 cm−1是由于C−H的伸缩振动；1 629 cm−1是由于C=O的伸缩振动[12]。红外光谱表明CDs-SiNWs的表面成功修饰了CDs，并具备用于固定抗体的羧基活性位点。
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图 2 SiNWs和CDs@SiNWs的基本表征 Fig. 2 Basic characterizations of SiNWs and CDs@SiNWs |
图3比较了CDs修饰前后SiNWs形貌的变化。图3（a）和3（b）是修饰前SiNWs的俯视图和截面图，从图中可以看出SiNWs分布均匀。TEM对CDs微观形貌进行表征。如图3（c）和3（d）所示，TEM图显示CDs粒径分布均匀，从高分辨TEM图中可以看到该CDs具有清晰的晶格条纹，测量其晶格间距为0.33 nm，对应于石墨碳的（002）晶面。图3（e）和3（f）显示了修饰CDs后SiNWs的形貌，对比CDs修饰前SiNWs的形貌几乎没有发生变化。由于CDs的尺寸只有10 nm左右，且负载量较少，因此，在SEM图中无法直接观察到CDs。
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图 3 SiNWs, CDs和CDs@SiNWs的形貌图 Fig. 3 Morphology of SiNWs, CDs and CDs@SiNWs |
为了探究CDs是否成功修饰于SiNWs表面，通过XPS对修饰后的SiNWs进行元素分析。如图4（a）所示，CDs-SiNWs的XPS全谱显示新增了N。进一步对各元素分析后，图4（b） C1s高分辨能谱显示，CDs-SiNWs上存在C=O（288.1 eV）、C−O（286.0 eV）和C−C/C=C（284.6 eV）3种不同类型的碳，这与CDs点中C种类一致[13]。图4（c）中N1s高分辨谱中，吡咯N和吡啶N也与CDs保持一致[14]。图4（d）中高分辨O1s谱显示，在533.2、532.2、531.4 eV处存在吸附氧、C−O和C=O，与CDs中O种类相对应[15-16]。此外，532.2、531.4 eV处C−O和C=O键表明CDs-SiNWs表面可能含有−COOH官能团，为后续生物传感器的构建提供活性位点。
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图 4 CDs@SiNWs的高分辨XPS谱图 Fig. 4 High-resolution XPS spectrum of CDs@SiNWs |
如图5（a）所示，CDs修饰首先提高了SiNWs的光电流密度，但随着Ab、BSA、Ag等蛋白质分子依次负载于电极表面，其光电流密度逐渐下降。图5（b）的电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy, EIS）表明了蛋白质连接过程中电极表面电阻变化情况。从图5中可以看到，CDs修饰明显降低了电极表面阻值，由于蛋白质的绝缘特性，随着电极表面连接蛋白质数量不断增加，电极阻值也在逐渐增大。EIS的变化进一步证明了Ab成功固定于电极表面。
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图 5 基于CDs@SiNWs的光电免疫传感器的逐步组装测试 Fig. 5 Stepwise assembly test of CDs@SiNWs-based photoelectrochemical immunosensor |
将不同浓度的cTnI分别滴加在免疫传感器电极表面，孵育1 h 后用PBS冲去未结合的抗原。每个浓度准备3个电极为平行实验。cTnI会与免疫传感器表面固定好的Ab发生特异性结合，非目标抗原不会结合在电极表面，免疫传感器在不同浓度的抗原溶液中结合不同数量的抗原；由于空间位阻效应，抗原结合在免疫传感器表面后，会引起免疫传感器光电流密度变化。图6（a）显示，随着抗原浓度的增加，光电流密度逐渐降低。为了减少不同批次之间初始空白电极性能波动带来的影响，用光电流的相对变化值作为对不同浓度cTnI的信号响应值。I0表示空白电极的光电流值，I表示某浓度cTnI下光电流信号。以光电流下降的百分比（I0-I）/I0作为纵坐标，cTnI 浓度取对数作为横坐标作图，其线性关系如图6（b）所示。检测结果显示，在0.005～5.000 ng/mL内，cTnI 浓度与光电流下降百分比成线性关系，线性方程为Y=0.434 92+0.179 65X，线性相关系数R2=0.97，cTnI 的检测下限（LOD）为3.79 pg/mL（S/N=3）。
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图 6 基于CDs@SiNWs的光电免疫传感器对cTnI检测性能 Fig. 6 Performance of CDs@SiNWs-based photoelectrochemical immunosensor for cTnI detection |
本文采用金属辅助化学蚀刻法制备了SiNWs，CDs用于SiNWs表面改性，可促进电子的转移，并进一步连接cTnI抗体。基于CDs@SiNWs制备的光电免疫传感器具有较好的检测性能，在0.005～5.000 ng/mL，cTnI抗体浓度与光电流下降百分比成线性关系，线性方程Y=0.43492+0.17965X，线性相关系数为0.97，cTnI的检测下限（LOD）为3.79 pg/mL（S/N=3），实现对cTnI的超灵敏检测，在生物免疫传感领域具有一定的应用潜力。
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