2023, Vol. 44
2. 上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 200011;
3. 上海市医疗器械检验研究院，上海，200233
2. Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200011, China;
3. Shanghai Medical Device Test Center, Shanghai 200233, China
钛及钛合金具有优越的耐腐蚀性能、力学性能和良好的生物相容性，被广泛用作骨科植入物[1]。钛及钛合金本身没有抗菌能力，植入人体后易发生细菌感染，这就需要二次手术，增加了患者的痛苦和医疗费用[2]。临床研究发现，骨植入物最常见的感染菌是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌[3]，发生细菌感染后，会在表面形成生物膜，降低抗菌药物的药效，提高抗菌难度，因而，植入物早期能够抑制细菌生物膜的形成是提高骨植入手术成功率的关键。
通过阳极氧化可以在钛片表面生成TiO2纳米管（titanium dioxide nanotubes, TNT）涂层，该涂层具有纳米级别的表面粗糙度和亲水性，有利于骨细胞的黏附和增殖[4]。TNT涂层表面的骨细胞生成能力较普通钛及及钛合金提高了3～4倍，并且具有促进钙沉积的作用[5]。一个合格的种植体在具有良好成骨能力的同时，还应具有较强的抗菌能力。有研究将抗菌药物装载到TiO2纳米管中，来提高TNT涂层的抗菌能力，但是该方法无法控制药物的释放，药物在短时间内快速释放，无法起到长久有效的抗菌作用。
金属−有机框架（metal-organic frame, MOF）材料由有机配体和金属离子或离子簇组成，具有比表面积高、孔隙率高和化学结构可调等特点，受到极大的关注[6]。沸石咪唑脂骨架材料（简称ZIF-8）是MOF材料中最常见的一种，是由无毒金属离子(Zn2+)和2−甲基咪唑基配体通过自组装合成的多孔材料，具有高孔隙率、低细胞毒性以及高化学稳定性等特性，已广泛应用于生物医学领域[7-8]。Zn作为人体必需的微量元素之一，在人体中起着重要作用[9]，可以刺激成骨基因的表达，提高碱性磷酸酶的活性，促进骨细胞分化。此外，Zn还具有良好的抗菌能力，可以穿透细菌的细胞膜，使细菌的生理功能发生紊乱，导致细菌死亡[10-11]。ZIF-8可在人体环境中缓慢降解，释放出Zn2+，可以起到抗菌作用。
ZIF-8具有多孔结构和很好的稳定性，可以作为药物的载体。庆大霉素（gentamicin, GEN）作为一种广谱的抗菌药物，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较强的抑制作用，可以装载到ZIF-8的孔隙中。在人体环境中，ZIF-8能够长时间保持稳定，实现药物的缓慢释放[12-13]。ZIF-8中由于Zn2+和配体的弱配位作用，在酸性条件下降解加速，表现出明显的pH响应效应[14]。当种植体出现细菌感染时，周围组织呈现弱酸性环境，ZIF-8降解加速，释放出更多的药物，起到更好的杀菌作用。
本研究中，将GEN与ZIF-8结合，应用到钛基植入物中，制备具有良好生物活性和长久抗菌能力的涂层。测试GEN的装载情况、ZIF-8的降解和GEN的释放速率。通过体外细胞培养和细菌培养试验评估该涂层的生物相容性和抗菌能力。
1 试验方法 1.1 TNT涂层的制备将钛片在不同目数的砂纸上打磨光滑，在无水乙醇溶液中超声10 min，然后在50 mL抛光液（HF∶HNO3=1∶4，体积比）中浸泡30 s进行化学抛光，取出后用去离子水冲洗并吹干。阳极氧化前，将钛片依次在丙酮、无水乙醇和去离子水中各超声10 min，烘干。阳极氧化的电解液为质量分数0.5%的NH4F和体积分数5.0%的乙二醇溶液，在60 V的恒压下电解1 h，阳极氧化后用去离子水冲洗、烘干。为了提高纳米管阵列与基体的结合强度，在马弗炉中进行退火处理，温度450 ℃，保温时间2 h。
1.2 ZIF-8涂层的制备将0.11 g六水硝酸锌和0.02 g GEN溶解在20 mL去离子水中，将2.27 g的2−甲基咪唑（C4H6N2）溶解在20 mL去离子水中，分别搅拌至溶液澄清。然后将2−甲基咪唑溶液倒入Zn(NO3)2溶液中，搅拌20 min后，溶液变为乳白色。将溶液转移到衬有特氟隆的高压釜中，然后将制备好的TNT样品垂直放置在25 mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压反应釜中，在36 °C加热1 h取出钛片，用去离子水漂洗，并在烤箱中于37 °C干燥24 h，可获得GEN@ZIF-8-TNT涂层。将反应釜中的溶液在8 000 r/min的转速下离心10 min，将得到的固体用去离子水洗涤3次，然后37 °C下真空干燥24 h得到纯净的GEN@ZIF-8粉末。ZIF-8涂层和ZIF-8粉末用同样的方法制备。
1.3 样品表征采用X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）对粉末样品进行分析，扫描速度为5°/min，2θ范围为10°～50°。通过傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）分析ZIF-8载药前后红外图谱的变化，使用KBr颗粒作为背景，扫描范围为4 000～400 cm−1。采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察不同涂层表面形貌。使用物理吸附分析仪在−196 ℃下测量了ZIF-8粉末的氮气吸附−脱附等温曲线。采用接触角仪测试不同样品表面的亲水性。
1.4 Zn2+释放速率将GEN@ZIF-8-TNT样品在5 mL的磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡1，2，4，8，12，24，48，72，96，120 h，每个时间节点收集样品溶液，并加入新的PBS溶液。利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪测试浸提液中Zn2＋的含量。
1.5 GEN释放速率将样品在5 mL的PBS缓冲液中分别浸泡1，2，4，8，12，24，48，72，96，120 h，温度为37 ℃，无搅拌。在每个时间点收集样品溶液并用紫外−可见漫反射光谱仪（UV-visible diffuse-reflectance spectrum, UV-Vis DRS）进行分析，以确定溶液中GEN@ZIF-8-TNT释放的GEN的量。
1.6 生物相容性评估采用CKK-8法评估不同材料的生物相容性，在24孔板中接种500 μL密度为5×104个/mL的MG63细胞悬浊液，在37 ℃下，在体积分数为5%的CO2的潮湿气氛中培养3 d和7 d后，分别加入CKK-8溶液，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
1.7 抗菌能力评估本研究使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为菌源。利用细菌涂板法分析细菌在琼脂板上培养后的菌落数量。将相同浓度的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬浮液接种到不同的基质上，在37 ℃下培养6 h。去除培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗两次，然后将样品转移到新的24孔板中。将黏附细菌在1 mL PBS缓冲液中进行超声分离，时间为5 min，然后将所得菌悬液稀释10 000倍，将处理后的100 μL菌悬液均匀地涂在琼脂培养板上，培养24 h。
2 结果与讨论 2.1 样品表征通过SEM观察钛片、TNT涂层、ZIF-8-TNT涂层、GEN@ZIF-8-TNT涂层的表面形貌，如图1所示。图1（a）中钛片表面由化学抛光处理引起的一些小凹坑清晰可见；从图1（b）中可以看出，在钛片表面成功制备出TNT涂层，TiO2纳米管分布均匀，平均直径为120～150 nm，壁厚为10 nm左右；从图1（c）可以看出，在TiO2纳米管表面原位生长出均匀的ZIF-8晶粒，ZIF-8晶粒呈现正十二面体结构，尺寸为300～500 nm；图1（d）中载药GEN@ZIF-8-TNT涂层形貌与ZIF-8-TNT涂层的形貌相比变化不大，GEN@ZIF-8晶粒仍呈现正十二面体结构，表明装载药物后，ZIF-8的结构不发生改变。
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图 1 不同样品表面的SEM图 Fig. 1 SEM images of different samples |
为了研究制备的ZIF-8的纯度和ZIF-8中药物的装载情况，通过XRD、FT-IR对从母液中离心得到的ZIF-8粉末、GEN@ZIF-8粉末进行分析。从图2的XRD谱图中可以看出，合成的ZIF-8的特征峰的位置与文献[15]中报道的一致，没有明显的杂质峰，说明试验成功制备了纯净的ZIF-8。装载药物后，GEN@ZIF-8的特征峰的位置没有发生改变。从图3的FT-IR谱图中可以看出，ZIF-8中C―H的拉伸震动出现在2 926 cm−1处，咪唑环中C＝N的拉伸振动出现在1 570 cm−1处，C―N拉伸振动出现在1 145 cm−1和994 cm−1处。与ZIF-8的FT-IR谱图相比，GEN@ZIF-8的FT-IR谱图中出现了GEN的特征峰，说明GEN成功装载到ZIF-8的孔隙中。
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图 2 ZIF-8和GEN@ZIF-8的XRD谱图 Fig. 2 XRD patterns of ZIF-8 and GEN@ZIF-8 |
孔隙尺寸和比表面积是表征多孔材料非常重要的参数，孔隙的尺寸和体积将显著影响材料的性能。通过图4的氮气吸附−脱附曲线可以看出，ZIF-8表现出I型等温线，在相对压力较低时，吸附量快速上升，达到一定相对压力时，吸附量达到饱和。通过氮气吸附−脱附试验测得ZIF-8中存在中孔和小孔，平均孔径在2 nm左右，有利于药物的装载和储存。GEN@ZIF-8的比表面积为437 m2/g，小于ZIF-8的比表面积(658 m2/g)，这一结果也进一步证实了GEN分子成功装载到ZIF-8中。
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图 3 ZIF-8，GEN，GEN@ZIF-8的FT-IR谱图 Fig. 3 FT-IR spectra of ZIF-8, GEN and GEN@ZIF-8 |
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图 4 ZIF-8和GEN@ZIF-8的氮气吸附−脱附曲线 Fig. 4 Nitrogen adsorption-desorption curves of ZIF-8 and GEN@ZIF-8 |
图5为不同样品表面的接触角。结果表明，钛片、TNT涂层、ZIF-8-TNT涂层、GEN@ZIF-8-TNT涂层表面的接触角依次为98.45°，9.27°，15.27°，17.27°。经过阳极氧化处理后，样品表面的接触角明显减小，具有很好的亲水性，TNT涂层表面原位生长出ZIF-8晶粒后，接触角略微增大，这与ZIF-8的疏水性有关，但整个涂层仍表现出较好的亲水性，涂层表面亲水性越好，越有利于细胞的黏附。
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图 5 不同样品的接触角 Fig. 5 Contact angles of different samples |
Zn2+和GEN的释放速率曲线如图6和图7所示。可以看出，Zn2+和GEN的释放动力学曲线的走势基本相似，在初始阶段都有一个突然释放的过程，之后释放速度趋于平缓，在pH=5.0的酸性环境下，释放速度明显快于pH=7.4的中性环境的。
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图 6 Zn2+的释放速率曲线 Fig. 6 Release rate curves of Zn2+ |
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图 7 GEN的释放速率曲线 Fig. 7 Release rate curves of gentamicin |
ZIF-8降解发生如下反应：
Zn (C4H6N2)2+H2O↔Zn2++C4H6N2+OH−1
在初始阶段药物的快速释放，可能是TNT涂层中吸附的药物快速释放造成的。在酸性环境下，药物的释放速度加快，这是因为ZIF-8具有pH响应性，在中性环境中的ZIF-8具有很好的稳定性，GEN主要通过ZIF-8的空隙缓慢向外扩散；在pH=5.0的酸性条件下，ZIF-8的稳定性变差，ZIF-8的结构会发生一定程度的崩塌，降解速率加快，进而导致药物释放速率加快。
2.3 生物相容性本试验通过CKK-8法测试了不同样品的细胞毒性。从图8中可以看出，细胞分别培养3 d和7 d后，与钛片相比，TNT涂层的生物相容性最好，ZIF-8-TNT涂层、GEN@ZIF-8-TNT涂层与钛片相比没有明显的区别，都表现出良好的生物相容性。
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图 8 培养时间与细胞活力的关系图 Fig. 8 Relationship between culture time and cell viability |
涂层表面的成分、形貌、亲水性等都会影响细胞的黏附、增殖、分化。与钛片相比，TNT涂层、ZIF-8-TNT涂层、GEN@ZIF-8-TNT涂层的水接触角更小，具有很好的亲水性，亲水性表面有利于初始阶段细胞的黏附和增殖。Zn作为人体必需的微量元素，参与人体内环境的新陈代谢[16]，适量的Zn2＋浓度对细胞有益，而较高浓度的Zn2＋会使细胞产生氧化应激反应，诱导细胞内部产生过量的活性氧，导致细胞死亡[17-18]。ZIF-8具有良好的稳定性，可以缓慢降解，从而控制Zn2＋的释放，使Zn2＋的浓度保持在安全范围内。
2.4 抗菌能力抗菌能力也是评估骨植入物生物性能的重要参数，本研究通过在样品表面培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来评估钛片和不同涂层的抗菌能力。如图9所示，与钛片相比，TNT涂层对大肠杆菌的生长没有影响，ZIF-8-TNT涂层和GEN@ZIF-8-TNT涂层表现出明显的抗菌能力，GEN@ZIF-8-TNT涂层的抗菌能力最强。以金黄色葡萄球菌为研究对象的抗菌研究也获得了相似的发现，表明GEN@ZIF-8-TNT涂层具有较强的抗菌能力，能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的增殖。
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图 9 在琼脂板上培养后的菌落生长状况 Fig. 9 Colony growth conditions after culture on agar plates |
GEN@ZIF-8-TNT涂层的抗菌能力主要来自于ZIF-8降解释放出的Zn2+和GEN。在ZIF-8中，由于金属离子与配体的弱配位作用，ZIF-8会缓慢降解释放出Zn2+，一部分Zn2+会在细菌的细胞膜表面聚集，改变细胞膜的通透性，导致细菌的细胞质外流，最终导致细菌凋亡[19]。还有一部分Zn2+会穿过细菌的细胞膜，在细菌内部积累，这部分Zn2+会诱导细菌内部活性氧的产生，活氧性在细菌内的积累会使细菌的生理功能发生紊乱，导致细菌死亡[20-21]。此外，GEN也具有较强的抗菌能力，GEN能够干扰细菌蛋白质的合成，从而抑制细菌的繁殖。GEN的释放分为两个阶段，第一阶段为TNT中GEN的快速释放，第二阶段为装载在ZIF-8中的GEN的释放，GEN的分阶段释放可以提高GEN@ZIF-8-TNT涂层的长久抗菌能力。研究表明，碱性环境不利于细菌的增殖，ZIF-8的降解会释放出OH−，营造出弱碱性环境，OH−会干扰细菌与外环境之间的质子循环，从而抑制细菌主要能量来源三磷酸腺苷的合成，进而抑制细菌的繁殖[22]。总之，GEN@ZIF-8-TNT涂层的抗菌能力来自于Zn2+，GEN，OH−的共同作用。
3 结 论本研究成功将抗菌药物GEN装载到ZIF-8中，并将GEN@ZIF-8与TNT结合，制备出了具有良好生物相容性和长久抗菌能力的GEN@ZIF-8-TNT复合涂层。ZIF-8在PBS溶液中具有良好的稳定性，可以控制Zn2+和GEN的释放，使得GEN@ZIF-8-TNT涂层表现出良好的生物相容性，同时具有长久的抗菌能力。GEN@ZIF-8-TNT涂层的良好的抗菌能力，得益于ZIF-8降解释放出的Zn2+，OH−，GEN的共作用，Zn2+诱导细菌产生氧化应激反应，改变细菌细胞膜的通透性；GEN干扰细菌蛋白质的合成，OH−干扰细菌内部三磷酸腺苷合成，抑制细菌繁殖。GEN@ZIF-8-TNT涂层为GEN和ZIF-8在骨科种植体上的应用提供了一种新的思路。
致谢感谢上海市高性能医疗器械材料工程中心(批准号：20DZ2255500)对本工作的资助，以及在生物相容性检测部分支持。
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