2025, Vol. 46
生物医用钛合金（Ti6Al4V）因其优良的生物相容性、高比强度、高耐腐蚀性能等优点，现已在医疗手术器械、种植体等医用材料领域得到了较广泛的应用[1]。但是，Ti6Al4V植入物不具备抵抗细菌感染的能力，植入人体后会释放Al离子和V离子，导致感染和其他疾病[2]。为了解决上述问题，羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）由于其良好的生物活性和骨传导性被广泛用作金属植入材料的活性涂层，但HA与Ti6Al4V的结合力较差，容易发生界面剥离以及产生裂纹，导致涂层的耐腐蚀性能下降[3-4]。为了提高涂层/金属种植体界面的结合强度和涂层的抑菌性能，可以对钛合金基体表面进行预处理[5-6]、在涂层中加入生物惰性陶瓷[7]和抑菌离子。Cu2+、Zn2+、Ag+等可以通过取代Ca2+进入HA结构，有助于提高表面的抑菌性能[8-11]。众所周知，Ag和Cu具有良好的抑菌作用，但是必须考虑其潜在的细胞毒性[12-14]，在抑菌元素中，Zn表现出优越的抑菌行为，与Ag、Cu等其他金属元素相比，具有更好的细胞相容性和生物安全性[15]。
本文对基体材料Ti6Al4V 分别开展了酸蚀处理、碱热处理以及先酸蚀后碱热处理，探究不同处理方式对溶胶−凝胶法在上述处理后的 Ti6Al4V 表面制备 HA 涂层的影响，以及TiO2-HA（掺杂Zn2+）复合涂层的制备及其生物学性能。本研究的目的在于通过制备新型复合涂层，解决目前Ti6Al4V植入体涂层存在的与基体结合强度低、耐腐蚀性能差以及缺乏抑菌性能的问题。
1 材料与方法 1.1 Ti6Al4V表面预处理本试验选用的基体材料为Ti6Al4V，使用线切割机将Ti6Al4V切成尺寸为10 mm×10 mm×3 mm的方块，随后用400～2 000 目砂纸逐级打磨（机械处理），然后依次在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗30 min后烘干。将上述机械处理并清洗后的样品使用质量分数为1.5%的HF酸蚀处理10 min，再用去离子水冲洗后干燥，分别将酸蚀处理前、后的样品浸泡在5 mol/L的 NaOH溶液中进行碱热处理，碱热处理工艺为：在60 ℃下浸泡24 h，然后在600 ℃下热处理1 h。
Ti6Al4V表面预处理方式见表1。
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表 1 Ti6Al4V表面预处理方式 Tab. 1 Surface pretreatment methods for Ti6Al4V |
按照（Ca+Zn）与P原子比为5∶3、Zn与（Ca+Zn）物质的量比为7∶100的配比，制备HA（掺杂Zn2+）溶胶原料。称取0.475 mol Ca(NO3)2·4H2O、0.035 mol ZnNO3·6H2O和0.015 mol P2O5分别置于不同的烧杯中，在每个烧杯中加入适量的无水乙醇使各物质充分溶解。将Ca（NO3）2·4H2O和ZnNO3·6H2O溶液混合后，在恒温水浴锅中60 ℃下搅拌2 h，将P2O5溶液缓慢加入Ca（NO3） 2·4H2O溶液中，在恒温水浴锅中60 ℃下加热3 h后过滤，调节pH至8.0，然后陈化24 h。
为了制备TiO2溶胶与粉末，将20 mL钛酸丁酯溶于10 mL无水乙醇中，加入5 mL冰醋酸作为抑制剂，室温下搅拌 30 min，得到第1份溶液。在另1个容器中，将3 mL HNO3、6 mL去离子水和80 mL无水乙醇混合，得到第2份溶液。将第2份溶液加入到第1份溶液中，在室温下搅拌5 h。首先，按照TiO2与HA质量比为3∶20的配比，将TiO2溶胶加入到HA（掺杂Zn2+）溶胶中，在室温下搅拌2 h后，陈化24 h，得到TiO2-HA（掺杂Zn2+）溶胶后，在90 ℃下干燥；然后，在550 ℃下煅烧，得到试验所需粉末。
首先，将预处理后的样品以 1 mm/s的速率浸入制备好的溶胶中，浸泡2 min后，以3 mm/s的速率将其缓慢取出；然后，在60 ℃下干燥2 h；最后，在550 ℃煅烧2 h。
表2为不同涂层主要成分。
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表 2 不同涂层主要成分 Tab. 2 Main components of the different coatings |
使用X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）观察样品的物相组成。使用配备能量色散光谱仪（energy dispersive spectroscopy, EDS）的扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察样品的微观组织。通过界面张力测量仪，利用水滴法检测样品表面润湿性，使用5点拟合法计算样品表面的接触角，每个样品随机选取3个位置，获得具有标准差的平均值。
1.4 耐腐蚀性能测试采用电化学工作站通过电位极化法测定了涂层的耐腐蚀性能。本试验采用的三电极系统，由工作电极（样品）、参比电极（饱和甘汞电极）和辅助电极（Pt）组成，选择pH为7.4的模拟体液（simulated body fluid，SBF）作为电解质，测试温度保持在37 ℃，样品的工作面积为1 cm×1 cm。利用由Tafel曲线得到的自腐蚀电流密度来评价样品的耐腐蚀性能。
1.5 抑菌性能测试为了测试复合涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性能，将菌液用Luria-Bertani培养基稀释至菌液浓度为106 CFU/mL。然后在样品表面滴加100 μL稀释菌液，每个样品表面覆盖一层薄膜并轻轻按压，最后放入恒温培养箱中，在37 ℃培养24 h。培养结束后，用900 μL灭菌磷酸缓冲盐（phosphate buffered saline, PBS）溶液冲洗样品表面。取冲洗液用灭菌 PBS 溶液稀释 10 倍，然后将 100 μL 稀释后的菌悬液均匀涂布于培养基表面，置于 37 ℃恒温培养箱中培养 24 h，观察并计数菌落数量。样品的抑菌率计算公式为：
| $\qquad R=(N_0-N_i)/N_0 \times100 {\text{%}}$ | (1) |
式中：R为抑菌率；N0、Ni分别为对照组、试验组菌落数量。
2 结果与讨论 2.1 粉末物相分析图1是不同溶胶粉末的XRD谱图。TiO2相为锐钛矿结构，在2θ为25.8°、38.25°、48.54°、54.4°、55.57°处分别出现衍射峰，分别对应于TiO2的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）晶面。HA的XRD谱图表现出高强度的峰，与HA的标准谱图匹配良好。HA（掺杂Zn2+）的XRD谱图表现出与HA相似的衍射模式，当掺杂Zn2+时，Zn2+取代Ca2+导致HA的衍射峰强度降低，因为Zn2+的半径（0.074 nm）小于Ca2+的半径（0.099 nm），当Zn2+取代Ca2+会导致HA的晶格收缩，同时也会生成磷酸三钙（tricalcium phosphate, TCP）[2]。在HA（掺杂Zn2+）后加入TiO2导致衍射峰的强度减弱，由于HA（掺杂 Zn2+） 和TiO2的主峰非常接近，TiO2占比较低，因此TiO2峰与HA（掺杂Zn2+）峰重叠。
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图 1 粉末样品的XRD谱图 Fig. 1 XRD patterns of the powder samples |
图2是Ti6Al4V表面经不同预处理后的SEM图。由图2（a）可知，经MP后的Ti6Al4V表面是一个光滑的平面。由图2（b）可知，经AE处理后的Ti6Al4V表面出现了尺寸不一、均匀分布的凹坑，同时出现了纵横交错的微米级别山峦状纹路。由图2（c）可知，经AH处理后的Ti6Al4V表面形成了与人的皮质骨结构相似的微纳分级多孔网状结构，呈海绵状三维立体网状形状。由图2（d）可知，AAH处理后的 Ti6Al4V 表面出现了明暗程度不一的现象，整体具有完整的网状结构、更加致密且偏向纤维化，并有团簇结构产生。
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图 2 Ti6Al4V表面经不同预处理后的SEM图 Fig. 2 SEM images of Ti6Al4V surface after different pretreatments |
图3为Ti6Al4V表面经不同预处理后制备的HA涂层的SEM图。由图3（a）可知，MP/HA涂层表面有严重的裂纹，基体表面没有被完全覆盖，这些裂纹产生的原因可归结为 HA 固有的脆性。由图3（b）可知，AE/HA 涂层表面的裂纹有所减少。由图3（c）可知，AH/HA涂层表面的裂纹进一步减少，涂层更加致密。由图3（d）可知，AAH/HA涂层表面裂纹增加，涂层不均匀，可能是因为Ti6Al4V表面（见图2d）生成的致密且纤细的网状结构和团簇形状结构不利于HA的浸涂，导致裂纹增加。因此，AH处理Ti6Al4V表面更适合后续的溶胶−凝胶法浸涂HA涂层。
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图 3 Ti6Al4V表面经不同预处理后制备的HA涂层的SEM图 Fig. 3 SEM images of HA coatings on Ti6Al4V surfaces prepared by different processes |
图4为AH/TiO2-HA涂层、AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层的SEM图。由图4（a）可知，HA涂层中添加TiO2可减少涂层表面的裂纹，并提高了涂层的均匀性。由图4（b）可知，TiO2和Zn2+的共同作用，使HA涂层更加均匀、致密。可见，对Ti6Al4V表面进行AH处理，并在HA涂层中添加TiO2和Zn2+能够提高涂层与基体之间的结合强度，减少裂纹，使涂层更加均匀。
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图 4 AH/TiO2-HA和AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层的SEM图 Fig. 4 SEM images of AH/TiO2-HA coating and AH/TiO2-HA (doped with Zn2+) coating |
利用EDS对AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层表面的元素分布进行分析。由图5可知，Zn在涂层表面均匀分布，表明涂层中成功地掺杂了Zn2+。
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图 5 AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层的EDS分析结果 Fig. 5 EDS analysis results of TiO2-HA (doped with Zn2+) composite coating |
生物材料表面特性（表面粗糙度、亲水性、拓扑结构等）会直接影响其生物学性能，如细胞黏附、增殖等。固体表面与液体接触角的大小能够反映液体对固体表面的润湿情况，接触角越大，润湿性越差，反之则越好。影响涂层亲水性的主要因素有3个：表面自由能、亲水基团和涂层的微观结构。图6为不同涂层表面与水的接触角，与MP/HA涂层相比，AH/HA涂层表面的接触角明显减小，因为AH/HA涂层更加完整（见图3），因此，HA涂层表面更有利于水的扩散。
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图 6 不同涂层表面与水的接触角 Fig. 6 Contact angles of water on different coating surfaces |
图7为不同涂层的极化曲线。从图7的极化曲线中获得的开路电压（U）、腐蚀电势（Ecorr）、腐蚀电流密度（Icorr）见表3。结合表3和图7的测试结果测出，MP/HA的Icorr为2.630×10−6 A/cm2，表面耐腐蚀性能较差，AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层的Icorr为0.426×10−8 A/cm2，在这5种涂层中最小，表明该涂层的耐腐蚀性能最好。由于涂层表面存在大量裂纹，基体中的 Al、V 等离子可通过裂纹通道快速释放至 SBF溶液中。在电化学腐蚀行为中，含裂纹或缺陷的涂层区域作为阳极，无缺陷的完整涂层区域则作为阴极，形成局部腐蚀微电池。由于阴阳极区域彼此独立，阳极反应（如金属溶解）与阴极反应（如氧还原）得以持续进行，进而在阳极位置诱发点蚀等局部腐蚀现象。涂层表面的纳米微孔网状中间层减少了涂层的裂纹数量，消除了接口中的间隙。AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层中裂纹的减少会导致腐蚀过程中阳极和阴极反应受到干扰。涂层的裂纹减少后，SBF溶液中的腐蚀性离子不易穿透涂层。此外，金属离子不能从基底表面分离出来，更不会在SBF溶液中释放，因此AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层的耐腐蚀性能最好。
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图 7 不同涂层的极化曲线 Fig. 7 Polarization curves of different coatings |
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表 3 不同涂层的电化学参数 Tab. 3 Electrochemical parameters of different coatings |
采用扩散平板法，选用革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠杆菌来评估不同涂层的抑菌性能。图8为不同涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果图。从图8中可以看出，AH/HA涂层上的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量都少于MP/HA涂层上的。AH/TiO2-HA涂层中2种菌的数量进一步减少，AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层中2种菌的数量最少，说明TiO2的抑菌效果显著，但TiO2与Zn2+的联合抑菌效果更优。
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图 8 不同涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果图 Fig. 8 Antibacterial effects photos of different coatings on E. coli and S. aureus |
图9为不同涂层表面大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落数量。根据式（1），并结合图9的测试结果，计算得出，TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为69.3%和96.9%。
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图 9 不同涂层表面大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落数量 Fig. 9 Numbers of E. coli and S. aureus on different coating surfaces |
TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层的抑菌活性来自Zn2+和TiO2，当TiO2受紫外光照射时，会产生活性氧物种，这些活性氧物种具有强氧化性，可以破坏细菌的细胞膜和DNA，从而实现抑菌的目的。Zn2+从涂层中释放到周围环境中，并在涂层表面产生活性氧，当与细菌细胞膜接触时，溶液中的Zn2+由于库仑力的存在而被牢固地吸附在细胞膜表面，改变了细胞膜的通透性，从而损害细胞膜的完整性。此外，Zn2+通过细胞壁和细胞膜，与细胞质中的蛋白质以及核酸中的某些官能团发生反应，阻碍核酸、RNA和DNA的正常合成，降低细菌内合成酶的活性，最终达到抑菌效果。
3 结 论（1）粉末样品的XRD分析表明，通过溶胶−凝胶法成功合成了TiO2-HA（掺杂Zn2+）复合材料。
（2）溶胶−凝胶法在Ti6AlV4表面制备的涂层有大量不均匀的裂纹。AH处理后加入TiO2、Zn2+可以有效减少涂层中的裂纹，使涂层更加均匀、致密。涂层的表面润湿性和电化学试验表明，AH处理后加入TiO2、Zn2+，使涂层的表面润湿性和耐腐蚀性能显著提高。
（3）抑菌试验结果表明，AH处理后加入TiO2和Zn2+，提高了HA涂层的抑菌性能，AH/TiO2-HA（掺杂Zn2+）涂层对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最好。
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