急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）因其高死亡率已经成为最严重的心血管疾病之一^[1]。心肌肌钙蛋白I （cardiac troponin I, cTn I）被认为是检测AMI的黄金标志物^[2]。目前，检测cTn I的技术包括电化学法^[3]、电化学发光法^[4]、酶联免疫吸附法^[5]和胶体金免疫层析法^[6]等。然而，这些检测方法存在操作步骤繁琐、重复性较低的问题 。

表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scattering, SERS）技术因其独特的分子特异性和较高的灵敏度而备受关注^[7-8]。SERS因其出色的光稳定性、无创检测能力和定量分析能力而成为一种重要的物质分子结构和成分检测技术。近年来，具有一定酶模拟活性的纳米酶材料逐渐兴起，它们具有化学稳定性强、用途广泛、制备简易等优点^[9-10]。大多数纳米酶是基于新型金属构建的，如金、银、金银合金等，它们是SERS检测的理想底物^[11]。已有研究^[12]将SERS和纳米酶材料的类酶活性相结合构建具有较低检测限的检测系统。与半导体MoO₃相比，MoO₂呈现金属特性，如高导电性、高熔点、高化学稳定性等^[13-14]。MoO₂中存在大量自由电子，使其展现出很强的局域等离子体效应。将金纳米星(Au nanostars, Au NSs)与半导体材料复合，一方面可以发挥Au NSs与MoO₂之间的协同作用，极大地增强了拉曼（Raman）信号，从而实现cTn I的高灵敏检测；另一方面，将 Au NSs 负载到 MoO₂表面，可使 Au NSs 不易被氧化，从而提高 Au NSs 的稳定性。本文所制备的基于 MoO₂@Au NSs 的 SERS 传感器，在对 cTn I 的检测中展现出了良好的线性范围（0～5 ng/mL）和较低的检出限（0.002 5 ng/mL）。同时，本研究通过对该传感器进行表征，深入探究了其性能特点。

1 试　验 1.1 MoO₂@Au NSs的制备

采用液相合成法制备Au NSs^[15]。第1步，在圆底烧瓶中加入50 mL 质量分数为0.01%的HAuCl₄ 溶液，在油浴中使溶液沸腾；随后，在磁力搅拌下快速加入1 mL 质量分数为1.00%的柠檬酸钠溶液，30 min后，形成金纳米球种子溶液，记为溶液A。第2步，将25 mL去离子水和2 mL溶液A混合；在磁力搅拌下，加入0.5 mL的 25 mmol/L HAuCl₄和0.05 mL的1 000 mmol/L HCl，搅拌3 min后，加入0.5 mL的2 mmol/L AgNO₃和0.25 mL 的100 mmol/L 抗坏血酸。在此过程中，溶液的颜色迅速从浅黄色变为蓝黑色。继续搅拌约10 min，得到试验所需的Au NSs溶液。

通过水热法合成了MoS₂纳米片^[16]。将0.8 mmol的（NH₄）₆Mo₇O₂₄·4H₂O和26.0 mol的CH₄N₂S加入到40 mL的去离子水中，室温搅拌10 min得到均匀的溶液。将所得溶液转移至衬有特氟隆的100 mL不锈钢高压釜中，并在180 ℃下反应12 h后冷却至室温，倒出上清液后离心以收集黑色沉淀物，并分别用去离子水和无水乙醇依次洗涤5次。最后，将上述样品在60 ℃干燥12 h，得到MoS₂粉末，加入Au NSs后在管式炉中煅烧，温度为250～450 ℃，最终获得多孔MoO₂@Au NSs。

1.2 表征设备

扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、拉曼光谱仪（Raman spectrometer，Raman）、X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）、X射线光电子能谱仪（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）。

1.3 Raman测试

纳米标签的合成步骤：第1步，将0.140 mL的四甲基联苯胺（tetramethyl benzidine, TMB）溶液添加至1 mL 的MoO₂@Au NSs溶液中，随后对该混合物进行强力涡旋操作，以实现充分混合，然后将其至于4 ℃下保存12 h，得到溶液B。第2步，向溶液B中加入0.1 mL 500 µmol/L的羧基聚乙二醇硫醇（COOH-PEG-SH）溶液，搅拌均匀后在4 ℃下孵育12 h，得到溶液C。第3步，向溶液C中分别加入0.005 mL的40 mg/mL EDC溶液和0.005 mL的110 mg/mL NHS溶液，在黑暗中轻轻搅拌15 min后加入0.01 mL 0.1 mg/mL的抗体溶液，在4 ℃孵育12 h，记为溶液D。

标准磷酸盐（phosphate buffered saline, PBS）缓冲液环境测试：测试前向溶液D中滴加0.11 mL H₂O₂，待溶液迅速变为天蓝色后，取出0.010 mL纳米标签和0.01 mL不同浓度的标准PBS缓冲液抗原样品，依次滴入载玻片的凹槽中，在37 ℃下反应30 min，然后进行Raman测试（使用633 nm波长激光，下同）。

人体血清环境测试：测试前向溶液D中滴加0.11 mL H₂O₂，待溶液迅速变为天蓝色后，取出0.01 mL纳米标签和0.01 mL不同浓度的人体血清抗原样品依次滴入载玻片的凹槽中，在37 ℃下反应30 min，然后进行Raman测试。

2 结果与分析 2.1 材料结构表征

图1为MoO₂粉末的煅烧时间与Raman强度的关系。从图1中可以看出，350 ℃煅烧得到的MoO₂粉末的Raman强度最高，其原因可能是此温度能将MoS₂粉末完全煅烧。

图2为MoO₂和MoO₂@Au NSs粉末样品的SEM图。由图2可知，MoS₂为片状，厚度约为43 nm。Au NSs尺寸约为60 nm，由于静电吸附作用均匀地吸附在MoO₂表面，无聚集现象。

图3（a）XPS全谱图显示，MoO₂@Au NSs由Mo、O、Au组成。如图3（b）～3（d）所示，Mo⁶⁺ 3d_3/2、Mo⁵⁺ 3d_3/2、Mo⁶⁺ 3d_5/2和 Mo⁵⁺ 3d_5/2均存在对应的特征峰；Au 4f_7/2和Au 4f_5/2对应84.35、88.08 eV处的特征峰。此外，O的主峰可以拟合为3个独立的特征峰，结合能从高到低依次为533.48、531.78、529.68 eV，分别对应吸附氧（O_A）、空位氧（O_V）和晶格氧（O_L）^[17]。MoO₂@Au NSs的XPS谱图也证明了其成功生成。

2.2 纳米酶活性分析

为了探究MoO₂@Au NSs的过氧化物酶样活性，进行了在H₂O₂存在条件下催化氧化TMB的典型反应。MoO₂@Au NSs能够催化H₂O₂分解，同时TMB分子被氧化成氧化型TMB，随着反应进行，反应体系的颜色由无色迅速变为蓝色。氧化型TMB在紫外吸收光谱的 652 nm 处有很强的吸收峰，同时，其在Raman光谱中1 170 、1 349、607 cm⁻¹处存在特征峰，这表明制备的MoO₂@Au NSs具有高SERS活性。由图4可知，当TMB、MoO₂@Au NSs和H₂O₂都存在时，溶液的颜色迅速变为蓝色。这表明MoO₂@Au NSs具有过氧化物酶模拟活性。

图5为MoO₂@Au NSs反应时间与SERS强度的关系。由图5可知，Raman强度随着反应时间的延长逐渐增强，这可能是由于反应时间的延长促使溶液中氧化型TMB分子数量增加，进而使得Raman强度增强。

图6为MoO₂@Au NSs催化活性调节。如图6所示，随着TMB、H₂O₂和MoO₂@Au NSs体积的增加，MoO₂@Au NSs的催化活性增强。随着反应时间的延长，MoO₂@Au NSs的催化活性增强。由上述试验结果分析得出，MoO₂@Au NSs类过氧化物活性的较佳反应条件为：0.350 mL MoO₂@Au NSs、0.140 mL TMB、0.110 mL H₂O₂、0.100 mL 乙酸钠缓冲液，较佳反应时间为10 min。

2.3 纳米酶催化活性机制分析

为了研究MoO₂@Au NSs的催化活性机制，利用米氏方程来计算其最大反应速率（V_max）和米氏常数（K_m）。如图7（a）所示，先保持H₂O₂浓度不变，调节TMB的浓度，利用紫外吸收光谱进行检测，从而计算出1条标准曲线。每隔5 s进行记录，并利用标准曲线计算反应的TMB浓度，从而计算出反应速率，如图7（b）所示。最后如图7（c）所示，在H₂O₂浓度不变的前提下，利用米氏方程的双倒数形式计算出最大反应速率和米氏常数。MoO₂@Au NSs具有更低的K_m和更大的反应速率，这意味着其具有更强的亲和力。当保持H₂O₂浓度不变时，不同浓度TMB底物的K_m为0.658，Vmax为17.749。当保持TMB浓度不变时，H₂O₂底物浓度变化时，K_m为1.237，V_max为25.491。

2.4 SERS传感器性能研究

试验用激光Raman显微镜研究了SERS传感器基底材料MoO₂@Au NSs的表面均匀性。从图8（a）可以看出，MoO₂@Au NSs作为SERS传感器基底材料，具有优异的信号均匀性和一致性，这与Raman观察到的均匀形貌完全一致。此外，从图8（b）可以看出，MoO₂@Au NSs的SERS信号均匀，且SERS性能稳定。

为了评估MoO₂@Au NSs的敏感性，进行了cTn I的检测试验。首先，在PBS缓冲液环境中制备不同浓度的cTn I标准溶液（0～5 ng/mL）。如图9（a）和图9（b）所示，随着cTn I浓度的增加，SERS信号逐渐增强，检出限为0.0025 ng/mL。为了进一步量化这种关系，拟合了Raman信号与标准PBS缓冲液环境中cTn I浓度之间的曲线（如图9c所示）。得到的曲线方程为I=1733.383+593.247X，R²=0.993。同时，使用从心肌梗死患者获得的血清进行临床样本检测，见图9（d）。cTn I浓度与相应的SERS信号之间存在很强的线性相关性。该临床数据集的曲线方程为I=1364.008+510.618C，R²=0.975。重要的是，真实心肌梗死患者血清中cTn I的检出限达到0.005 ng/mL。值得注意的是，在标准PBS缓冲液环境中得到的线性关系与患者真实血清环境表现出高度的一致性。这些结果强调了MoO₂@Au NSs优异的稳定性和生物相容性，使得MoO₂@Au NSs SERS传感器具有较高的灵敏度。

3 结　论

本文将MoO₂@Au NSs与表面增强Raman散射相结合，Au NSs材料由于其独特的结构获得较强的过氧化物酶活性，可极大地提高对cTn I的检测灵敏度，与半导体MoO₂相结合后可以实现cTnI的稳定检测。基于MoO₂@Au NSs制备的SERS传感器具有较好的检测性能，在0～5 ng/mL，cTn I浓度与Raman信号成线性关系，线性方程I =1733.383+93.247X，线性相关系数R²=0.996，cTn I的检测下限为0.0025 ng/mL，实现对cTn I的超灵敏检测，在生物免疫传感领域具有应用潜力。