2024, Vol. 45
金属离子不易产生耐药性，因此选用Zn2+、Mg2+等作为促成骨和抗菌因子来改善钛表面的性能[1-2]。金属有机框架（metal-organic framework, MOF）材料是抗菌及骨再生应用中有效的表面改性剂[3]。基于Zn2+的MOF材料在体外和体内具有低毒性或无毒性[4]。Zn-MOF材料在分解过程中会释放Zn2+和有机配体。一方面，Zn2+能促进BMSC的成骨分化[5]，增加成骨细胞的胶原蛋白分泌和钙沉积，促进骨形成[6]，抑制破骨细胞进行骨吸收[7]；另一方面，有机配体也对成骨因子表达有积极作用[8]。
ZIF-8具有药物递送[9]、可持续释放药物、pH响应[10]的能力，在酸性环境下释放Zn2+，从而达到抗菌[11]、促进成骨细胞分化[12-14]。与其他多孔生物材料相比，ZIF-8具有可控且更经济的合成、优异的热稳定性、化学稳定性[15]及良好的生物相容性[16]等优点。Chen等[17]在多孔钛表面制备了由纳米尺度和微米尺度的沸石咪唑盐框架-8（ZIF-8）晶体组成的Zn基MOF膜，其纳米ZIF-8膜不仅增强了MG63细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性、细胞外基质矿化和成骨基因（ALP，Runx2）的表达，还抑制了变形链球菌的生长。
Mg2+作为一种良好的生物金属元素，具有优异的抗菌、抗炎性能和促成骨性能，被广泛用于医疗领域[18]。Kang等[19]利用Mg2+的成骨性能，合成了一种外泌体功能化的无细胞PLGA/Mg-GA MOF（PLGA/Exo-Mg-GA MOF）支架，该支架可以同时增强成骨、血管生成和抗炎能力。
为了进一步提高ZIF-8的抗菌性及促成骨活性，本实验提出将Mg2+掺杂到ZIF-8中，合成Mg@ZIF-8纳米颗粒。实验选用Mg（NO3）2·6H2O作为Mg2+源，在低温下合成Mg@ZIF-8，探究Mg2+浓度对ZIF-8的影响，并通过抗菌实验、体外矿化实验研究Mg@ZIF-8的抗菌性及促成骨性能。
1 实验方法 1.1 材料与设备用于制备ZIF-8及Mg@ZIF-8的试剂为Zn（NO3）2·6H2O、二甲基咪唑、Mg（NO3）2·6H2O、去离子水、无水乙醇、氢氧化钠等，均为分析纯。测试设备有：扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、能谱仪（energy disperse spectroscopy, EDS）、X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）、傅里叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）、电感耦合等离子体光谱仪（inductively coupled plasma atomic emission spectrometer, ICP-AES）。
1.2 制备方法 1.2.1 Mg@ZIF-8的制备采用溶剂热法制备Mg@ZIF-8。称取一定量二甲基咪唑、Zn（NO3）2·6H2O、Mg（NO3）2·6H2O粉末，分别加入去离子水并搅拌均匀，配成一定比例的溶液，Mg2+、Zn2+、二甲基咪唑的原子分数比分别为0.5:1:70、1:1:70、1.5:1:70、2:1:70。将配置好的二甲基咪唑溶液倒入不同浓度的Mg（NO3）2·6H2O溶液中反应5～10 min，然后再将混合溶液倒入Zn（NO3）2·6H2O溶液中反应5～10 min，得到Mg@ZIF-8溶液。将Mg@ZIF-8溶液以8 000 r/min的转速离心，在80 ℃干燥一夜后可得Mg@ZIF-8固体粉末，样品记为Mg1@ZIF-8、Mg2@ZIF-8、Mg3@ZIF-8、Mg4@ZIF-8。
1.2.2 Mg@ZIF-8@AHT的制备将碱热处理后的钛片表面清洗干净，用无水乙醇、去离子水超声清洗各3次，每次15 min。将碱热处理后的钛片浸泡在不同Mg2+浓度的Mg@ZIF-8溶液中15 min后取出，低温烘干，得到表面附着Mg@ZIF-8的钛片，即Mg@ZIF-8@AHT。样品制备流程图见图1。
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图 1 Mg@ZIF-8@AHT制备流程图 Fig. 1 Schematic diagram of preparation process of the Mg@ZIF-8@AHT |
利用SEM和EDS对Mg@ZIF-8进行表征，分析其表面形貌及成分；利用XRD分析Mg@ZIF-8的结构特征，扫描速率为3 （°）/min，扫描角度2θ为5°～50°；选用FT-IR分析Mg@ZIF-8的官能团，波长为400～4 000 cm−1；用界面张力测量仪及配备的数码相机和图像分析软件检测Mg@ZIF-8@AHT的浸润性，滴量为5 μL，间隔时间为10～20 s；采用ICP-AES检测Mg@ZIF-8中Mg2+和Zn2+的释放浓度，将Mg@ZIF-8@AHT标本浸泡在3 mL的磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline, PBS）中，在37 ℃无搅拌条件下分别浸泡6、12、24、48、96 h，并在每个时间点收集渗滤液，用ICP测试滤液中Mg2+和Zn2+的浓度。
1.4 抗菌实验 1.4.1 细菌培养选择大肠杆菌（escherichia coli, E.coli，ATCC25922）和金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus, S.aureus，ATCC29215）分别作为革兰氏阴性、阳性细菌的代表，选择LB液体/固体培养基进行培养。
1.4.2 抗菌率评价采用平板计数法来考察各组钛片的抗菌能力，实验步骤如下：
（1）用接种环在大肠杆菌菌板上蘸取部分菌落于50 mL准备好的LB液体培养液中，然后放入37 ℃振荡培养箱内进行10 h细菌培养。
（2）将测试材料放入孔板中，取1 mL的菌液浸没材料，置于37 ℃条件下培养24 h。
（3）将离心管、LB琼脂液、枪头等物品进行灭菌处理。
（4）24 h后，取出培养的细菌菌液，用无菌PBS冲洗钛片，去除钛片表面黏附的细菌。在每个孔中加入1 mL的无菌PBS溶液，在超声条件下振荡5 min。
（5）在离心管与LB琼脂板上进行标名后，取悬浮液加入到离心管中，振荡摇匀，稀释菌液。重复多次操作至菌液浓度分别为10−4、10−5、10−6倍。
（6）分别取50 μL上述3种浓度菌液加入到LB琼脂板中进行涂布，每种菌液涂3板。涂布前需对涂布器进行灭菌，且培养皿开口处靠近酒精灯，防止其他细菌进入。
（7）涂布后将LB琼脂板置于37 ℃的培养箱中进行细菌培养，24 h后取出，观察细菌的生长情况与菌落数量。
1.5 体外矿化实验将Mg@ZIF-8@AHT放入20 mL的0.2 mol/L的CaCl2溶液中浸泡3 min，取出后浸入蒸馏水（dH2O）中5 s；再放入烘箱中干燥3 min；烘干后置于20 mL的0.2 mol/L的K2HPO4溶液中浸泡3 min后取出；浸入dH2O中5 s；再放入烘箱中干燥3 min。以上步骤循环操作3次。
将不同Mg2+浓度的Mg@ZIF-8@AHT装入有40 mL SBF溶液的离心管中，置于37 ℃恒温培养箱中保存，隔天换液。在3、7 d时间点取样，用dH2O浸泡清洗，以去除在表面结晶的NaCl，放置在空气中干燥。将矿化后的Mg@ZIF-8@AHT作表面喷金处理，置于SEM中进行形貌表征。
2 结果与讨论 2.1 Mg@ZIF-8表征图2为ZIF-8、Mg@ZIF-8、ZIF-8@AHT的SEM图。图2（a）、2（c）中ZIF-8表现为菱形十二面体结构，尺寸为200～400 nm。图2（c）、2（d）中的ZIF-8已经成功负载到钛片表面的网状结构中。图2（e）、2（f）中Mg@ZIF-8呈菱形十二面体结构，尺寸为200～400 nm，这和ZIF-8结构一致。负载到碱热处理后的钛片上的形貌如图2（g）、2（h）所示，Mg@ZIF-8均匀地附着在钛片表面的网格中。
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图 2 ZIF-8、Mg@ZIF-8、ZIF-8@AHT的SEM图 Fig. 2 SEM images of the ZIF-8, the Mg@ZIF-8 and the ZIF-8@AHT |
表1和表2分别是ZIF-8和Mg@ZIF-8的EDS分析结果。从表1中可以看出，ZIF-8中含有C、N、Zn、Au等元素。从表2中可以看出，Mg@ZIF-8中含有C、N、Zn、Mg、Au等元素。EDS检测不出H，有机物可根据C、N两种元素来判别，因此，可判断Mg@ZIF-8是含有有机物、Zn2+、Mg2+的聚合物。根据上述元素分析结果推测，已成功将Mg 2+掺杂到ZIF-8结构当中。由于样品进行了喷金处理，所以导致了Au的出现。
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表 1 ZIF-8负载到钛片上的元素组成 Tab. 1 ZIF-8 composition of elements loaded onto the titanium sheet |
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表 2 Mg@ZIF-8负载到钛片上的元素组成 Tab. 2 Mg@ZIF-8 composition of elements loaded onto the titanium sheet |
图4（a）为ZIF-8和Mg@ZIF-8的XRD谱图，可以看到，合成的ZIF-8与标准ZIF-8卡片（
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图 4 样的品XRD谱图和FT-IR图 Fig. 4 XRD patterns and FT-IR spectra of the samples |
图5（a）是Zn2+在PBS溶液中的释放情况，Zn2+在pH为7.4时缓慢释放，在pH为6.0时的释放速率增大。图5（b）是Mg2+在PBS溶液中的释放情况，Mg2+在pH为7.4时缓慢释放，在pH为6.0时的释放速率增大。Mg@ZIF-8在酸性溶液中Zn2+和Mg2+的释放速率增大，这与MOF材料在碱性环境下稳定、酸性条件下分解的性质一致。
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图 5 样品的ICP表征 Fig. 5 IPC characterization of the samples |
图6是不同浓度的Mg@ZIF-8负载的钛片的浸润性表征分析。从图6中可以看出，掺杂Mg2+后，钛片表面的接触角增大，且随着Mg2+浓度的增加，接触角从8.50°增大到23.75°，这可能是因为随着离子浓度的升高，有机配体和金属离子的比例逐渐升高，引发Mg@ZIF-8纳米粒子尺寸减小，进而导致接触表面更加光滑。
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图 6 ZIF-8和Mg@ZIF-8的浸润性表征 Fig. 6 Infiltration characterizations of the ZIF-8 and the Mg@ZIF-8 |
使用扩散平板法，选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来评估样品的抗菌性能。不同样品上的大肠杆菌如图7（a）所示，随着Mg2+浓度的增加，对大肠杆菌的抗菌性也随之增加。大肠杆菌的抗菌率如图7（c）所示，低浓度和高浓度的Mg2+对大肠杆菌的抗菌率分别为2.7%和100%。不同样品上的金黄色葡萄球菌如图7（b）所示，其抗菌率如图7（d）所示，随着Mg2+浓度的升高，Mg@ZIF-8对金黄色葡萄球菌的抗菌率依次为17.3%、43.3%、−14.9%、−25.0%，这可能是因为随着Mg2+浓度的提高，预防了核糖体胁迫下的细菌超极化现象，促进了细菌生长[20]。因此，Mg2@ZIF-8对这两种细菌的抗菌率都有所提升。
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图 7 样品的菌落图片和抗菌率 Fig. 7 Colony pictures and bacteriostatic rates of the samples |
图8是ZIF-8@AHT和Mg@ZIF-8@AHT浸泡在SBF模拟体液中3 、7 d的表面矿化情况。如图8（a）、8（b）所示，在3 d时，ZIF-8@AHT和Mg@ZIF-8@AHT表面均有结晶沉淀，沉淀首先在ZIF-8、Mg@ ZIF-8周围沉积，随着结晶物的堆积最终将ZIF-8和Mg@ZIF-8淹没。图8（c）、8（d）为矿化后的各元素的含量，矿化3 d后，Mg@ZIF-8@AHT表面结晶沉积物中Ca含量更高，原子分数为21.27%；矿化7 d后Mg@ZIF-8@AHT中Ca含量明显上升，原子分数为51.64 %，且Ca含量已经超过Zn含量，说明有源源不断的Ca、P离子从SBF模拟体液中析出，沉积在矿化位点或已形成的钙磷沉积上。因此，Mg@ZIF-8可诱导钙磷在晶体结构内均匀沉积，随着时间的延长，形成的混合矿化物出现团聚、变大等现象。
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图 8 样品的SEM图及EDS分析结果 Fig. 8 SEM images and the EDS analysis results of the samples |
本文主要通过溶剂热法制备出了具有纳米尺寸的MOF材料Mg@ZIF-8，并对其抗菌和促成骨性能进行了研究，主要结论如下：
（1）Mg@ZIF-8呈正十二面体结构，尺寸为200～400 nm，具有和ZIF-8相似的框架结构及官能团，在酸性条件下框架解体，离子释放速率加快。将Mg@ZIF-8加载到钛片表面后接触角从8.50°增大到23.75°，整体亲水性变化不大。
（2）与ZIF-8相比，Mg@ZIF-8对大肠杆菌的抗菌性增强，且随Mg2+浓度的增加，抗菌率从2.7%增加到100%；少量的Mg2+掺杂对金黄色葡萄球菌的抗菌性能也有所提高，Mg2@ZIF-8对金黄色葡萄球菌的抗菌率提升最显著，为43.3%。
（3）与ZIF-8相比，Mg@ZIF-8的Ca沉积性能增强，矿化3 d后Ca的质量分数从14.89%增加到21.27%，矿化7 d后Ca的质量分数从47.76%增加到51.64%。
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