2024, Vol. 45
2. 上海交通大学医学院附属第九人民医院, 上海 200011;
3. 上海市医疗器械检验研究院, 上海 200233
2. Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200011, China;
3. Shanghai Medical Device Test Center, Shanghai 200233, China
金属-有机框架材料（metal-organic frameworks, MOFs）是由金属离子与有机配体通过自组装杂化而成的一类具有周期性的三维网状结构的多孔材料[1]。MOFs具有大的比表面积，且其孔洞可调，在催化及吸附领域有广阔的应用前景[2-4]。MOFs所具备的性能使其在装载和释放药物方面也受到了更多的关注。传统的药物载体通常为脂质体、蛋白质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、树枝状高分子等。相比传统的药物载体，MOFs更能提高药物的生物利用率，延长药物在体内的循环时间，降低药物高浓度带来的副作用等，而且能更好地体现靶向性[5]。
沸石咪唑酯骨架结构材料（zeolitic imidazolate framework, ZIF）是MOFs的一个子类，由咪唑配体桥联四面体金属离子（Zn或Co等）组成。ZIF的合成简单可控，ZIF耐高温并在碱性环境下稳定[6]，ZIF在吸附、催化等领域得到了广泛的研究[7-8]，而其在的生物医学应用中的潜力也引起了越来越多的关注。据报道[9]，ZIF-90负载5-Fu和阿霉素用于肿瘤治疗，ZIF-90毒性低，与被广泛研究的ZIF-8相比，ZIF-90在结构上有其自身的特点。在不影响骨架完整性的前提下，可以将ZIF-90中的醛基转化为羧基、氨基、巯基等[10]。此外，ZIF-90在正常环境和碱性环境下保持稳定，在酸性环境下逐渐降解，是理想的作为pH敏感的药物输送平台。
左氧氟沙星（Levofloxacin, Levo）是喹诺酮类药物中的一种，其具有抗菌广谱、抗菌作用强的特点，对多数肠杆菌科细菌以及部分葡萄球菌都有良好的抗菌效果。
壳聚糖（chitosan, CS）含有氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖[11]。CS广泛存在于自然界中，获取方便。CS具有生物降解性、细胞亲和性、生物效应等许多独特的性质。ZIF-90中的醛基可以与氨基形成席夫碱键，从而达到更强的抗菌效果。此外，CS中氨基的质子化和去质子化可以导致结构的变化（膨胀和收缩）。当复合微粒在较低pH环境中膨胀时，被包裹的药物可以释放。相反，当复合粒子在中性或碱性条件时，将发生收缩，以防止药物分子的泄漏[12]。基于以上思路，本工作制备了新型生物相容性抗菌药物缓释系统Levo@ZIF-90@CS，对材料的结构和形貌进行了表征，对其药物释放及抗菌能力进行了研究。
1 试 验 1.1 ZIF-90的合成本文采用经济高效的回流法合成了ZIF-90。将咪唑-2-甲醛（96 mg，1 mmol）溶解于5 mL甲醇中，再加入0.1 mL的三乙胺（triethylamine, TEA），在室温下搅拌，然后将硝酸锌（147 mg，0.5 mmol）溶液加入到5 mL的甲醇中。将得到的液体混合后在70 ℃回流下搅拌20 min，然后在室温下搅拌60 min。用甲醇将所得样品充分洗涤3次，直到上层液体无色透明，然后样品在50 ℃的真空中干燥过夜，得到ZIF-90材料。
1.2 Levo@ZIF-90@CS的制备将咪唑-2-甲醛（96 mg，1 mmol）溶解于5 mL甲醇中和0.1 mL三乙胺中，同时，将Levo （60 mg, 0.2 mmol） 和硝酸锌（147 mg，0.5 mmol）溶解在5 mL甲醇中，将得到的混合液体在70 ℃回流下搅拌20 min。将所得样品用甲醇洗涤3次后在50 ℃的真空中干燥过夜，得到Levo@ZIF-90。
在合成Levo@ZIF-90时，回流搅拌后加入1 mL 的 NaOH(5 mol/L)和准备好的1 mL CS溶液（100 mL1% /v 醋酸溶液中加入0.的 g CS，室温下搅拌24 h），并在室温下搅拌12 h。用无水乙醇洗涤3次后真空干燥，得到Levo@ZIF-90@CS。
1.3 Levo标准曲线的制作将Levo溶解在PBS溶液中以配制不同浓度的Levo溶液。将Levo PBS溶液与盐酸溶液（0.1 mol/L）按体积比1:1混合后，通过紫外可见吸收光谱对其进行全波长扫描，确定其在PBS溶液中的最大吸收波长，在最大吸收波长下测试2.5、5.0、7.0、10 μg/mL的Levo溶液的吸光度，由此可得到不同浓度下的Levo在PBS溶液中的标准曲线。
1.4 药物释放性能测试将Levo@ZIF-90、Levo@ZIF-90@CS分别放于装有10 mL pH=5.5、10 mL pH=7.4的PBS溶液的透析袋中（共4袋），然后将其置于37 ℃的恒温摇床中（100 r/min）进行振荡。开始振荡后，每间隔1 h 吸取一次溶液并检测吸光度，一定时间后，延长间隔时间，并通过标准曲线计算药物的释放量。
1.5 抗菌性能测试选用大肠杆菌（革兰氏阳性菌）以及金黄色葡萄球菌（革兰氏阴性菌）为试验菌株来评价ZIF-90、Levo@ZIF-90@CS的抗菌能力。将冷冻的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在LB（luria-bertani，LB）液体培养基中接种过夜，培养活化菌株。离心收集细菌，然后用PBS稀释至细菌浓度为2×106 CFU/mL待用。
配置500 μg/mL不同样品（ZIF-90、Levo@ZIF-90@CS）的PBS溶液，将1 mL的不同样品溶液与1 mL的2×106 CFU/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌悬浮液依次加入到5 mL的离心管中，另外，将1 mL PBS溶液与1 mL 2×106 CFU/mL细菌悬浮液的混合液作为对照组。最后在37 ℃下恒温震荡（转速为100 r/min）培养3 h。试验结束后，每组样品中吸取10 μL加入至990 μL PBS溶液中进行稀释，将稀释液在LB固体培养基上进行涂板，37 ℃恒温培育12 h后，比较各组的抗菌效果。
1.6 样品的表征采用傅里叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）分析样品的化学基团，测量波长范围为500～3 200 cm−1；采用X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）分析样品的晶体结构，Cu Kα射线，加速电压为40 kV，电流为30 mA，扫描速度为5 (º)/min，扫描范围为10º～60º；对样品进行喷金处理，利用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察样品的表面形貌，扫描电压为3 kV；采用紫外-可见分光光度计（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）分析药物的释放，测量范围为250～400 nm，步长为0.2 nm。
2 结果与分析 2.1 样品的形貌分析采用SEM对ZIF-90和Levo@ZIF-90@CS的微观形貌进行分析。如图1（a）所示，ZIF-90为均匀的十二面体，粒径为2～3 μm，与文献[13]中报道的结果一致，证明了ZIF-90的成功合成。如图1（b）所示，Levo@ZIF-90@CS的形貌与ZIF-90的基本一致，Levo@ZIF-90@CS的棱角稍微模糊，说明CS的包覆没有改变材料的基本结构。
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图 1 ZIF-90和Levo@ZIF-90@CS的SEM图 Fig. 1 SEM images of ZIF-90 and Levo@ZIF-90@CS |
为了研究ZIF-90合成过程中其晶型结构的变化，用XRD分别对Levo、CS、ZIF-90、Levo@ZIF-90@CS进行分析，结果如图2所示。
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图 2 样品的XRD谱图 Fig. 2 XRD patterns of the samples |
合成后的ZIF-90峰型与文献[14]中相似，表明ZIF-90的成功合成。同时可以看出，当用CS进行表面改性合成Levo@ZIF-90@CS后，其XRD谱图与ZIF-90的基本相同，表明骨架保持稳定。XRD谱图中2θ=20°的衍射峰属于CS的第二类晶体[15]，这表明CS的成功包覆。如图2所示，Levo@ZIF-90@CS并没有表现出Levo的特征峰，这可能是因为Levo被包裹在骨架中，无法显示其晶型结构。
为了进一步证明Levo@ZIF-90@CS的合成，分别对CS、Levo、ZIF-90、Levo@ZIF-90@CS进行FT-IR分析，结果如图3所示。从图3中可以看出，Levo的特征峰出现在1 726 cm−1（―COOH振动）处，ZIF-90的特征峰出现在2 840 cm−1（C―H振动）和1 671 cm−1（C＝O振动）处，表明ZIF-90中存在醛基。Levo@ZIF-90@CS的光谱中并未出现Levo的特征峰，可能是因为Levo被包裹在孔洞内。同时Levo@ZIF-90@CS在1 651 cm−1（C―N振动）处形成了新的强伸缩振动吸收，醛基特征峰显著减小，这表明CS通过席夫碱共价加载到ZIF-90上[16]，验证了Levo@ZIF-90@CS的形成。
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图 3 样品的的FT-IR光谱 Fig. 3 FT-IR spectra of the samplea |
试验采用ZIF-90装载Levo，先通过UV-Vis确定Levo在PBS溶液中的最大吸收波长。如图4所示，Levo在PBS溶液中的最大吸收波长为292 nm[17]，根据最大吸收波长处2.5、5.0、7.0、10 μg/mL的Levo溶液的吸光度，制作Levo的浓度-吸光度标准曲线，回归方程为y = 0.112 5x + 0.048 9，拟合度R² = 0.999 9，说明相关性较好，如图5所示。根据浓度-吸光度标准曲线进行后续的药物释放试验。根据药物标准曲线计算出载药量为481 mg/g，在模拟的正常生理和细菌酸性环境（pH=7.4和pH=5.5）下评估药物释放性能[18]。可以看出，载有Levo的Levo@ZIF-90和Levo@ZIF-90@CS均表现出缓释特性和pH响应能力。如图6（b）所示，在酸性环境下（pH=5.5），Levo从Levo@ZIF-90@CS中约25 h内几乎完全释放，在pH=7.4的PBS溶液中，40 h内大约释放了60%的Levo。结合图6（a）可以看出，Levo从Levo@ZIF-90中的释放百分比明显大于从Levo@ZIF-90@CS中的释放百分比。Levo@ZIF-90@CS通过CS的修饰获得了更好的pH响应性，这与CS的固有特性有关：在较低的pH下，CS转化为溶胀的聚合物基质，将Levo@ZIF-90暴露在低pH环境中，导致ZIF-90被破坏，从而使Levo快速释放；另一方面，CS层在pH=7.4时表现出收缩机制，导致Levo的释放受限[19]。
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图 4 Levo的UV-Vis图 Fig. 4 UV-Vis Absorption Spectra of Levo |
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图 5 Levo标准曲线 Fig. 5 Standard curve of levo |
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图 6 样品在PBS溶液中的药物释放 Fig. 6 Release of Levo from the samples in PBS solution |
选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来评价材料的抗菌性能，结果如图7所示。与ZIF-90相比，Levo@ZIF-90@CS表现出了更强的抗菌能力。原因是：一方面，Levo@ZIF-90@CS通过席夫碱键接枝CS，增加了CS的分散性，而且席夫碱键对酸敏感，在酸性环境下断裂，CS在低pH环境下溶胀使得ZIF-90中的Levo更容易释放；另一方面，酸性环境下，ZIF-90容易坍塌，通过Zn2+的金属点位抗菌，也增强了抗菌效果，从而形成席夫碱键、Levo、Zn2+共同联合抗菌的效果[20-22]。
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图 7 样品的抗菌性能 Fig. 7 Antibacterial properties of the samples |
（1）试验利用ZIF-90中醛基和CS中氨基发生席夫碱反应，形成了席夫碱键，得到了Levo@ZIF-90@CS，并通过XRD和FT-IR确定了其结构，通过SEM确定了其十二面体的形貌。
（2）药物释放试验表明，Levo@ZIF-90@CS的合成提高了给药系统的pH响应性，并且延长了缓释时间。在酸性条件下（pH=5.5），Levo从Levo@ZIF-90@CS中约25 h内几乎完全释放，在中性环境（pH=7.4）中，40 h内大约有42%的Levo被释放。
（3）细菌试验表明，Levo@ZIF-90@CS对金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌都显示出了较好的抑制作用，并且其效果优于ZIF-90，这可能是席夫碱键、Levo、Zn2+共同抗菌的结果，
（4）通过CS在ZIF-90上的包覆，使得ZIF-90得到了更好的pH响应能力。Levo@ZIF-90@CS能在中性及碱性环境中缓慢释放Levo，在细菌形成酸性微环境下表现出更好的药物释放能力和抗菌性能，从而可以有效地进行靶向治疗。
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